La morfologia bacteriana puede ser estudiada de dos formas:
  1. Por visualizacin de los microorganismos vivos sin teñir lo que no permite observara su movilidad .
  2. Por visualizacion de los microorganismos teñidos mediante colorantes con una concentracion que le hace morir y permiten observara la movilidad.
En general todas la bacterias vivas son practicamente incoloras es decir no presenta suficiente contraste con el medio acuoso que se encuentra ; por tal razon es necesario teñirlas para que produzcan un contraste con repecto al medio que se encuentra.
Por todo esto las ventajas de las tecnicas de tincion son:
  • Permite diferenciar distintos tipos morfologicos
  • Establecer una informacion complementaria sosbre uss estructuras internas y/o externas.
  • Conocer sus caracteristicas tintoriales orientandonos hacia un grupo taxonomico para la clasificacion de las bacterias.
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FACTORES QUE AFECTAN A TODA TECNICA DE TINCION
las tecncas de coloracion constituyen una practica diaria en el laboratorio de microbiologia por los cuales se debera considerar una serie de factores que puedan alteras los resultados de los mismos. Asi pues los principales factores son:
  • Pureza del colorante.- a mayor grado de impurezasa mayor error y menor calidad de tincion.
  • Concentracion del colorante.- a mayor concentracion mayor error en la tincion; igual que a menor concentracion.
  • El pH del colorante.- este es un factor fundamental ya que depende de las estructuras que se desee observar para elegir el pH adecuado.
  • Conservacion del colorante .- se debe conservarse en lugares frescos, secos, y obscuros ; envasados y etiquetados.
  • Tecnica Empleada.- se debera seguir rigurosamente paso a paso cada tecnica de tincion.
  • Temperatura.- en la moyoria de los casos se utiliza la temperatura ambiental pero si existe algunas tecnicas que requieran de temperatura adecuada.
  • Cantidad de la muestra.- ebera ser representativa y homogenea pero no muy grande.
  • Realizar corresctamente el frotis.- se debe fijarse bien para que cuando se les añada los colorantes mordientes y decolorantes no arrastren a los microorganismos que se desee observar.
  • Soluciones mordientes.- en ciertos casos son necesarios ya que actuan como fijadores y ayudan a la fijacion del colorante a las correspondientes estructuras .
  • Tiempos de Tincion.- es necesario que todas las sustancias se mantengan en la preparcion un tiempo preciso y variable segun la tincion. (Obando Patricia)

METODOS DE TINCION
Se han desarrollado varios métodos de tinción para observar componentes celulares y tisulares.
Se los puede agrupar de la siguiente manera.
· Tinciones que se distinguen entre los componentes ácidos y básicos de la célula.
· Tinciones especiales que reconocen elementos particulares intra y extracelulares.
· Tinciones con sales metálicas que precipitan los tejidos y forman depósitos metálicos.
En ellos.

TECNICA DE TINCION
Toda tecnica de tincion requiere de los siguientes pasos:
  1. Realizacion de un frotis y fijacion posterioR
  2. Coloracion
  3. Decoloracion
  4. Lavado.
  5. Coloracion de contraste.
  6. Observacion ala microscopio.
TIPOS DE TINCIONES BACTERINAS
TINCION SIMPLE
Se caracteriza por:
  • Necesita fijacion previa.
  • Se utiliza un solo colorante y este debe ser basico (azul de metileno o fushina)
  • Permite la visualizacion la concentracion, morfologia y el modo de agrupacion bacteriana
TINCION NEGATIVA:
Es untipo de tincion simple pero con ciertas diferencias ya que nos permites observar caracteristicas estructurales de la bacteria ; se caractreriza por :
  • No necesita fijacion previa.
  • Se utiliza un solo colorante.
  • Nos permiten visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria y alguna otra estructura como es la presencia de capsula.
TINCIONES DIFERENCIALES
las tinciones diferenciales presenta la s siguientes caracteristicas:
  • Se necesita de fijacion previageneralmente por calor.
  • se utilizan dos colorantes siendo el ultimo colorante el de contraste
  • Nos permite visualizar su morfologia,y otras caracteristicas comp purde ser la composicion de la pared bacteriana
Dentro de de las tinciones diferencioales tenemos:
Tincion de Gram: es el metodo mas empleado en bacteriologia gracias al cual las bacterias se pueden clasificar en en dos grandes Grupos(Gram+, Gram-). Este distinto comportamiento de la tincion de gram es la distinta composicion de la pared de la pared celular de las bacterias . De acuerdo a esto al emplear el pimer colorante basico que es el cristal violeta se tinñen de color azul todas las bacterias , luego al poner el mordiente que es el lugol aument la afinidad del primer colorante , finalmente un agente decolorante decolorara un tipo de bacterias que seran teñidas con el colorante de contraste.
TECNICA:
  • Realizar el frotis y la fijacion

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  • Aplicar al porta objetos el primer colorante que puede ser cristal de violeta durante 1 minuto o violeta de genciana por 2minutos.


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  • Lavar con abundante agua Destilada para eliminar el exceso de colorante.
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  • Añadir un mordiente el lugol 1 minuto
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  • Se vuelve a lavar para eliminar el exceso de lugol.
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  • Decolorar con alcohol de 96·unos 20 segundos
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  • lavar con abundante agua
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  • Cubrir con el porta objetos el colorante de contraste (safranina 1 minuto)
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  • Lavar con agua para arrastrasr el resto de colorantes
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  • Observar con objetivo de immmersion.
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RESULTADOS:


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(Obando Patricia)




TINCION DE KINYOUN
Similar a la de Ziehl-Neelsen. La fijación se realiza con alcohol met�­lico. Se utiliza con preferencia para Nocardia pues es una bacteria parcialmente acido-alcohol resistente.
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TINCION DE ZIEHL-NEELSEN MODIFICADA PARA CRYPTOSPIRIDIUM
Similar a la tinción clásica en frio, hace la fijación con alcohol met�­lico, ayuda a preservar las estructuras celulares y su decoloración con H2SO4 al 2% en agua destilada pues resulta más suave.
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TINCION FLUORESCENTE CON AURAMINA O
Este tipo de tinción es muy utilizada para micobacterias, se da cuando el volumen de muestra a examinar es elevado. Se fundamenta en la afinidad que posee los ácidos micolicos de la pared celular de las micobacterias por los fluorocromos auramina O. Estas bacterias aparecen teñidas de amarillo fluorescente sobre un fondo negro y el resto de elementos se colorean de rojo.
La ventaja de este proceso es que permite realizar sobre ella la tinción acido-alcohol resistente con esta técnica también se colores Cryptosporidium.
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TINCIONES ESTRUCTURALES
Las tinciones estructurales presenta las siguientes caracteristicas:

  • Requieren fijacion previa generalmente por calor
  • Utilizan al menos dos colorantes.
  • Nos permiten observar su morfologia
  • Nos permiten visualizar otras caracteristicas de caracter estructural cmo son la presencia de esporas, flagelos, cilios, capsulas, etc.
Dentro de las tinciones estructurales tenemos :
Tincion de Esporas: Las espora sson estructuras bacterianas que se forman en condiciones adversas por parte de ciertas bacteria como puedes ser : del genero Bacillus y Clostridium.
Tales esporas son capaces de resistir situaciones muy desfavorables de ahi su denomonacion de resistencia. Las esporas se tiñen muy dificilmente requeriendo determinados colorante muy concentrados.
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TECNICA:
Metodo de Wirtz o verde de malaquita :
  • Cubrie el portaobjetos con solucion de verde de malaquita y calentar hasta la emision de vapores por unos 5 minutos impidiendo que el colorante se seque o se queme.
  • lavar con abundante agua.
  • Cubrir la preparacion con safranina o fucsina como colorantes de contraste durante 2 o 3 minutos
  • Lavar con abundante agua ,secar, rotular,y observara a inmersion.
Resultados: se observan esporas verdes

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Tincion de Flagelos: los flagelos se tiñen con mucha dificultad debido a que se suelen retraerse con facilidad si la tincion no es adecuada , de ahi que se requiere de tecnicas especiale y especificas basadas en la afinidad que los flagelos presentan frente a ciertas anilinas.
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TECNICA:
  • Realizar el frotis de cultivo joven y fijar.
  • Cubrir la preparacion con mordiente Rhodes durante unos 4 minutos.
  • Lavar con agua destilada.
  • Cubrir con nitrato de plata amoniacal al 5% calentandolo casi hasta ebullicion si dejar que se seque la solucion en la muestra durante unos 4 minutos.
  • Lavar con agua destilada, aplicar un cubre objetos y examinara a inmersion.
Resultado. los flagelos se observan por la precipitacion del nitrato de plata amoniacal sobre ellos lo que les da un aspecto pardo mas o menos oscuro que contrasta sobre el resto de la bacteria.

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La celula bacteriana puede tener uno o mas flagelos dispuestos en distinta manera y en base a eso se clasifican en :
  • polar :flagelo en un extremo.(A)
  • lofotrico: penacho de falagelos en un extremo (B)
  • anfitrico:flagelos en ambos extremos.(C)
  • peritrico: flagelos alrededor de toda la celula.(D)

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(Obando Patricia)
Bibliografia:
  • Granados Raquel microbiologia Tomo 2 pag:223..............245
  • Bravo Blanca Esthela Texto de MIcrobiologia pag: 28