MICROSCOPÍA ELÉCTRICA

La microscopio electrónico es un técnica que requiere instrumentos de alta complejidad, que utilizan electrones para iluminar un objeto.


Hay dos tipos de microscopios eléctricos:

  • Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
  • Microscopio electrónico de barrido (SEM)


MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (TEM)


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Microscopio electrónico de transmisión


Esta constituido por las siguientes partes:

  1. Cañón de electrones

  2. Sistema de lentes

  3. Pantalla fluorescente


Estos se encuentran en una columna vertical a alto vacío.


El cañón de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se encuentra en la parte superior de la columna.Esta constuido por un filamento que es cátodo, un cilindro con apertura central, llamado cilindro de Wehnelt que rodea al filamento. El ánodo se encuentra por debajo del cilindro de Wehnelt.

El filamento es calentado por el paso de corriente (alrededor de 2800K). Los electrones emitidos termoiónicamente por el cátodo son llevados acia el ánodo, estos pasan por la apertura del cilindro central y un haz de alta energía es emitido hacia la columna del microscopio.

El sistema de lentes constituido por lentes condensadores objetivo, intermedia y proyectora.

La lente objetivo forma la primera imagen, está localizada debajo del espécimen. Es considerado el componente más importante del microscopio electrónico. Cualquier defecto en ésta, será magnificado y transmitido al resto del sistema óptico. De ella depende la resolución final.

La lente intermedia y proyectora son las encargadas de amplificar la imagen dada por la lente objetivo y proyectarla sobre la pantalla fluorescente.

La pantalla del microscopio electrónico de transmisión está recubierta por una pintura de fluoruros de Zn y Cd, que fluoresce cuando es bombardeada por electrones, generando una imagen en el rango de las longitudes de onda del visible.


La resolución depende del espesor del corte del tejido. Es por eso que el empleo de micrótomos es fundamental para realizar cortes ultrafinos.


En siguiente video se explica que es un microtomo y cual es su función.










PREPARACIÓN DE LA MUESTRA


1. Fijación: La muestra debe ser fijada, endurecida y preservada con tetraóxido de osmio (OsO4) y glutaraldehído, con un cuidadoso manejo del pH, para mantener las membranas y las proteínas celulares. Los aldehídos crean puentes cruzados entre sí y enlaces covalentes con los grupos amino que estén libres en las proteínas. De esta manera se previene la degradación oxidativa por la muerte del espécimen.

2. Contraste: Los orgánulos y estructuras de interés deben ser electrón-densas y contrastar con el fondo (background). La electrondensidad se incrementa con el número atómico de los elementos y solo átomos pesados crean contraste. Se contrasta con tetraóxido de osmio, acetato de uranilo o citrato de plomo.

3. Deshidratación: El espécimen va a estar en el vacío y no puede contener agua, pues esta se evaporará y dispersará los electrones. El agua se elimina mediante alcoholes en grado creciente de concentración.

4. Inclusión: El espécimen deshidratado se coloca en óxido de propileno y resinas epóxicas o acrílicas, las cuales se endurecen y forman un bloque sólido de plástico muy duro.

5. Corte: Se emplea un ultramicrótomo que permite rebanar el tejido en cortes ultrafinos con una cuchilla de diamante, logrando cortes del orden de los 100 nm. Los electrones tienen un bajo poder de penetración y no es conveniente usar cortes gruesos.


APLICACIONES

  • Determinación de estructura cristalina en minerales, metales, etc
  • Estudio de catalizadores.
  • Determinación de impurezas, precipitados, etc.
  • Identificación de bordes de grano e interfaces en metales.
  • Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.
  • Determinación de tamaño de partícula en catalizadores, minerales, etc.
  • Identificación de planos cristalinos.
  • Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos térmicos.
  • Realización de estudios de histoquímica para identificar compuestos específicos.
  • Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales.
  • Reconocimiento de virus.
  • Estudios de citoquímica.
  • Estudios de estructuras moleculares.


IMAGENES OBTENIDAS DE TEM


POLÍMEROmicr2.gif
Células de un polímero




Cloroplastos
Cloroplastos


Placa Motora a nivel ME
Placa Motora a nivel ME



MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (SEM)



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Microscopio electrónico de barrido

Está constituida por las siguientes partes:

1. Cañón de electrones
2. Lentes condensadoras y objetivo,
3. Sistema de vacío.

De la misma manera que el TEM, este tipo de microscopio posee un cañón de electrones por donde se genera el haz de electrones. Y los mismos lentes condensadoras y objetivo.

La diferencia principal entre ellos es la manera en que forman la imagen. Esto hace que la información que se obtenga de cada uno es distinta. Mientras el TEM permite el estudio de la ultraestructura de muestras delgadas, el SEM posibilita conocer la morfología superficial.

En el microscopio electrónico de barrido, el haz electrónico, atraviesa la columna y llega a la muestra. Un generador de barrido es el responsable de producir el movimiento del haz, de manera que barra la muestra punto a punto.

De la interacción entre los electrones incidentes con los átomos que componen la muestra se generan señales, las cuales pueden ser captadas con detectores adecuados para cada una de ellas. El detector capta una señal y las convierte en señal electrónica que es proyectada en un tubo de rayos catódicos (CRT).

Cada señal emitida corresponde a un pixel de la imagen tridimensional formada en el monitor de la computadora.


PREPARACIÓN DE LA MUESTRA


La preparación de las muestras difiere un poco con relación a las muestras para el TEM, pues el microscopio electrónico de barrido muestra imágenes en tres dimensiones en aumentos de hasta 20.000x y una resolución que puede llegar a los 5nm.


1. Fijación: se trata a la muestra de la misma manera que el proceso de fijación para muestras en el TEM.

2. Deshidratación: Uno de los más utilizados es el de deshidratación por punto crítico en CO2, en el cual el agua pasa rápidamente de estado líquido a vapor sin ebullición.

3. Corte: Algunos especímenes no ameritan ser rebanados, pues se observará la superficie del mismo.

4. Contraste: El espécimen deshidratado es revestido por una capa de grafito o de oro.


APLICACIONES

  • Morfología superficial de minerales, catalizadores, etc.
  • Electrodepósitos
  • Adherencia fibra-matríz en polímeros.
  • Cambios morfológicos de materiales sometidos a tratamientos químicos.
  • Formas de cristalización de minerales.
  • Control de calidad de catalizadores industriales.
  • Morfología superficial interna de partículas poliméricas.
  • Morfología de tejidos u órganoS animales y vegetales.
  • Estudio de moléculas
  • Reconocimiento de fósiles.

IMAGENES OBTENIDAS DE SEM


Células sanguineas
Células sanguineas








Escherichia Coli
Escherichia Coli





Células de grasa
Células de grasa


Hoja de tabaco
Hoja de tabaco


RESOLUCION


El concepto de resolución está relacionado con la capacidad de distinguir detalles finos en una imagen, decir es la distancia mínima r1 a la cual podemos distinguir, claramente, dos puntos como entidades separadas.

La resolución teórica del microscopio electrónico es:

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Para valores de l = 0.037 Å y a = 0.1 radianes, la resolución nominal es 0.2 Å.


NATURALEZA DE LAS ONDAS DE ELECTRONES



De Broglie mostró que una partícula moviéndose a una velocidad cercana a la de la luz tenía una forma de radiación asociada con ella. Esta relación está expresada por:


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donde l es la longitud de onda, h la costante de Plank, m la masa de la partícula y v su velocidad.


Las ondas de electrones no deben confundirse con radiación electromagnética, como la que se produce cuando un haz electrónico interactúa con la materia, pierde energía y produce una radiación cuya longitud de onda pertenece al espectro electromagnético.


CORTES

Para los cortes de las muestras, se utliizan aparatos mecánicos denominados microtomos y existen diferentes tipos según el grosor que queramos conseguir. Los microtomos más usados son:

Microtomo para parafina: Se utiliza principalmente para material incluido en parafina y se obtienen secciones de 5 a 20 µm de grosor, para observar con el microscopio óptico.


Microtomo para parafina con mecanismo de rotación
Microtomo para parafina con mecanismo de rotación


Vibratomo: Corta material no incluido, aunque sí fijado o duro, en secciones de 30 a centenares de µm de grosor, para observar con el microscopio óptico.

Vibratomo. La cubeta, de color negro, ha de estar llena de tampón de trabajo durante el proceso de corte de manera que la cuchilla y la muestra, de color rojo, y las secciones que se obtienen están sumergidos.
Vibratomo. La cubeta, de color negro, ha de estar llena de tampón de trabajo durante el proceso de corte de manera que la cuchilla y la muestra, de color rojo, y las secciones que se obtienen están sumergidos.




Microtomo de congelación: Con él se consiguen secciones de 30 a unas 100 µm de material congelado para su observación con el microscopio óptico.

Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y se obtienen grosores de 10 a 40 µm, para observar con el microscopio óptico.


Microtomo de congelación. El tubo negro de la derecha es el encargado de enfriar el portabloques a temperaturas inferiores a -20 °C, lo cual congela a su vez a la muestra (color rojo). Las secciones se recogen de la cuchilla con un pincel y se colocan en tampón de trabajo.
Microtomo de congelación. El tubo negro de la derecha es el encargado de enfriar el portabloques a temperaturas inferiores a -20 °C, lo cual congela a su vez a la muestra (color rojo). Las secciones se recogen de la cuchilla con un pincel y se colocan en tampón de trabajo.





Criostato. El compartimento de color azul es la cámara refrigerada a la temperatura seleccionada. En esta cámara se encuentra la muestra, la cuchilla y es donde se recogen las secciones.
Criostato. El compartimento de color azul es la cámara refrigerada a la temperatura seleccionada. En esta cámara se encuentra la muestra, la cuchilla y es donde se recogen las secciones.




Ultramicrotomo: Con él se corta material incluido en resinas y se obtienen secciones del orden de nanometros de grosor, para observar con el microscopio electrónico de transmisión.


Ultramicrotomo
Ultramicrotomo

Ultracriotomo: Su uso no está muy extendido pero se suele emplear cuando se necesitan secciones del orden de nanometro de material que no se debe incluir, para observar con el microscopio electrónico de transmisión.





REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS