MICROSCOPÍA ÓPTICAexternal image fig306.jpg

external image light.microscope.jpg



El microscopio óptico es un instrumento que amplifica la imagen de un objeto pequeño y sumamente útil para el desarrollo de la microbiología como ciencia y para la investigación microbiológica.
Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico.
En el microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos, haciendo visible un objeto microscópico.
En general, el microscopio óptico se usa para observar células intactas.USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO

external image optico.gif


LÍMITE DE DE RESOLUCIÓN

Es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan visualizarse por separado.
El microscopio óptico tiene un límite resolución de cerca de 200 nm (0.2 µm ), en tanto que el microscopio electrónico puede incrementarlo en aproximadamente 1000 veces.

external image size_comp.gif


PODER DE RESOLUCIÓN:
Es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles más finos. Está en función de la longitud de onda usada y de la apertura numètica.
Está en relación inversa con el límite de resolución.
El lìmite del microscopio óptico es de 2000 veces.

APERTURA NUMÈRICA:
Medida de la capacidad de captación de la luz por la lente.


AUMENTO TOTAL:
Debemos notar que el ocular también tiene un aumento, por lo tanto el aumento total de la imagen que observamos es el producto entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproducción es 40:1 y nuestro ocular tiene un aumento de 10x, entonces el aumento total será 40 x 10 = 400.


PODER DE RESOLUCION:

La resolución de los microscopios ópticos está restringida por un fenómeno llamado difreacción que, dependiendo de la apertura numérica (AN o AN) del sistema óptico y la longitud de onda de la luz utilizada (λ), establece un límite definido (d) a la resolución óptica. Suponiendo que las aberraciones ópticas fueran despreciables, la resolución sería:
delta = frac { lambda } {2* A_N }
delta = frac { lambda } {2* A_N }

Normalmente, se supone una λ de 550 nm, correspondiente a la luz verde. Si el medio es el aire, la AN práctica máxima es de 0,95, y en el caso de aceite de hasta 1,5.
Ello implica que incluso el mejor microscopio óptico está limitado a una resolución de unos 0,2 micrómetros.



TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS:

  • Microscopio de campo claro
  • Microscopio de contraste de fases
  • Microscopio de Campo oscuro
  • Microscopio de fluorescencia





MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO

micrc.bmp



Es el microscopio óptico compuesto utilizado en la mayoría de los laboratorios de biología y microbiología. Para formar una imagen a partir de un corte histológico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan atravesarla. También se usan métodos de tinción, según las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen.
En general con este microscopio se pueden alcanzar los 1000 aumentos, pudiéndose llegar con ciertas modificaciones a 2000 y 3000 aumentos.


**DISEÑO DEL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO**



Nota.- Con el objetivo de imersión, se emplea aceite de inmersión, el cual posee un índice de refracción mayor que el aire, de tal forma que puede haber un aumento de apertura numèrica entre 1.2-1.4; y con esto, estos microscopios llegan a tener un poder de resoluciòn de aproximadamente 0.25 um.

external image 000437711.jpg





PRINCIPIO


external image mic1.jpg


Con este tipo de microscopio las muestras se visualizan gracias a las diferencias de contraste entre ellas y el medio que las rodea.
El condensador proyecta un cono de luz sobre las células que están siendo examinadas en el microscopio. Después de atravesar a las células, ese haz luminoso, en forma de cono, penetra en el objetivo; el objetivo proyecta una imagen aumentada en el plano focal del ocular, que nuevamente la amplia. Por fin la imagen provista por el ocular puede ser percibida por la retina del ojo como una imagen situada a 25 cm de la lente ocular.

VENTAJAS:
  • Por su costo, es el más empleado en biología y microbiología.

  • Permite la observación de estructuras microscópicas.


DESVENTAJAS:
Para poder observar una célula o tejido al microscopio de campo claro convencional hay que fijarla y hacerle una tinción, lo que implica, la muerte de la célula en cuestión.
El tejido debe cortarse finamente para ser examinado y mientras más delgado sea, más nítida será la imagen; pero con este método se pierde la información tridimensional durante el corte.
Si una muestra gruesa es observada con esta técnica, la imagen enfocada se deteriora a causa de las estructuras superpuestas borrosas o no enfocadas.




MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE
Microscopio de contraste de fases OLYMPUS CX31
Microscopio de contraste de fases OLYMPUS CX31


Las investigaciones iniciales de Frits Zernike al inicio de la década de 1930 revelaron que en microscopía, al crear interferencias en la luz empleada para iluminar el espécimen se creaban condiciones que producían un incremento del contraste. Este descubrimiento le valió el premio Nobel en física en el año 1953 y revolucionó la investigación en biomedicina al permitir el estudio de células vivas. Con esta técnica de iluminación se aumenta el contraste de manera notoria entre las partes claras y oscuras de las células transparentes.


PRINCIPIO

Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido.
Por medio del condensador, se logran separar los rayos luminosos que no son difractados por el objeto de los que no lo hacen, al pasar por la muestra, los rayos que atraviesan objetos más densos, experimentan un retraso de un cuarto de lambda, y al pasar por el anillo de fase estos rayos, debido a la forma del anillo de fase, estas ondas se retrasan un cuarto de lambda más, en cambio, las que no se han retrasado, pasan por una parte más delgada del anillo de fase y no se siguen retrasando. Entonces estos desfases de las ondas luminosas se perciben como diferencias en el contraste, en distintos tonos de gris.



external image microscopia+de+contraste+de+fase+4.JPG




Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas.

Esquema que muestra una célula sin coloración en la cual la parte con más espesor corresponde a la zona del núcleo C, el citoplasma a la zona delgada periférica B y el portaobjeto o solución acuosa circundante A. Existen diferentes índices de refracción entre A, B y C los cuales son invisibles al ojo humano. Las ondas que atraviesan una zona más espesa se retrasan y cambian de fase en relación a las ondas que atraviesan una región más delgada Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining
Esquema que muestra una célula sin coloración en la cual la parte con más espesor corresponde a la zona del núcleo C, el citoplasma a la zona delgada periférica B y el portaobjeto o solución acuosa circundante A. Existen diferentes índices de refracción entre A, B y C los cuales son invisibles al ojo humano. Las ondas que atraviesan una zona más espesa se retrasan y cambian de fase en relación a las ondas que atraviesan una región más delgada Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining


Es decir, que los heterogéneos componentes celulares absorben la luz de diferente manera y causan pequeñas variaciones de fase en las radiaciones luminosas, es decir, las retrasan ligeramente al disminuir la velocidad a la cual viajan y el retraso varía según el tipo de estructura. En las células y tejidos no coloreados, el escaso contraste se mejora y acentúa al transformar las diferencias de fase (invisibles al ojo humano) en diferencias de intensidad luminosa las cuales sí son detectables.





DISEÑO DEL MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES
Para convertir un microscopio convencional en uno de contraste de fases se sustituye el condensador y el objetivo por los de contraste de fases, los cuales contienen un filtro en anillo y una placa de fases respectivamente
Se adiciona un diafragma anular colocado debajo de la platina para iluminar el objeto con un cono de luz estrecho y una placa de difracción montada en el objetivo.
La fase relativa de luz desviada, saldrá 1/4 de longitud de onda retrasado, sí es capturada y cambiada con la introducción de un material retrasador de fase, en aquella parte de la placa de difracción que sea cubierta por cualquiera de los dos rayos, aumentando aún más, otro 1/4 de longitud de onda y logrando retrasar en rayo luminoso en total 1/2 longitud de onda, con lo que se logra que este rayo quede totalmente fuera de fase con respecto a la luz no desviada.
Cuando la diferencia se presenta es porque los índices de refracción son diferentes y el microscopio de contraste de fase transforma estas variaciones en brillo o intensidad. Las estructuras celulares presentan muchas irregularidades y son objetos ópticamente no homogéneos; así, la luz que "choca" con el objeto se presenta desviada.
Figura.- Diagrama para el microscopio de contraste de fases. K: filtro anular, L: vista transversal del filtro anular, M: condensador, O-O’: objetivo, P – P’: ocular, Q: diafragma del ocular. La placa de fases está colocada entre las lentes del objetivo y funciona como otro filtro que crea la difracción de la luz. a y b: configuración de los filtros para producir el contraste negativo o positivo respectivamente.
Figura.- Diagrama para el microscopio de contraste de fases. K: filtro anular, L: vista transversal del filtro anular, M: condensador, O-O’: objetivo, P – P’: ocular, Q: diafragma del ocular. La placa de fases está colocada entre las lentes del objetivo y funciona como otro filtro que crea la difracción de la luz. a y b: configuración de los filtros para producir el contraste negativo o positivo respectivamente.





external image microscopia%2Bde%2Bcontraste%2Bde%2Bfase%2B1.JPG



APLICACIONES
• Observación de células y tejidos vivos, sin necesidad de tinción.
• En estudios de diversas disciplinas como por ejemplo fisiología, parasitología, farmacología (procesos celulares, identificación y cuantificación de microorganismos y parásitos en fluidos y tejidos, efecto de medicamentos y otras sustancias en las células y sus procesos de motilidad, digestión, entre otros).
• Estudio de alimentos y medicinas.
• Análisis de materiales industriales (metales, cristales, fibras sintéticas, plásticos, pigmentos, emulsiones y suspensiones minerales).
• Estudios geológicos (minerales).

Fotografía al microscopio de contraste de fases de un cultivo tardío de B. thuringiensis.
Fotografía al microscopio de contraste de fases de un cultivo tardío de B. thuringiensis.


MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
external image microscopia+de+campo+oscuro+1.JPG

Es un tipo de microscopio óptico en el que el sistema de iluminación se presenta modificado de tal modo que la luz incide sobre la muestra sólo desde los lados.
La única luz que es capaz de entrar en el objetivo es la que es dispersada por la muestra por lo que los microorganismos se observan brillantes sobre un fondo oscuro, de manera similar a un cielo nocturno en el cual brillan las estrellas.
La iluminación de campo oscuro se puede realizar tanto mediante luz transmitida (trans-iluminación) como con luz incidente (epi-iluminación). En el primer caso, para lograr el efecto se requiere bloquear la parte central del rayo de luz que normalmente pasa a través y alrededor del espécimen, de tal manera que sólo sea iluminado por rayos oblicuos. La manera más fácil y económica de lograrlo consiste en colocar un filtro circular opaco (por ejemplo círculos de cartulina negra o una moneda adherida a un círculo de vidrio o plástico transparente) bajo el condensador de un microscopio compuesto ordinario. Esta maniobra funciona bien con objetivos de 10x-40x; el diámetro del circulo opaco debe ser de aproximadamente 16-18mm para un objetivo de 10x cuya apertura numérica sea de 0.25. Para un objetivo de 20x o 40x con una apertura numérica de 0.65, el diámetro del círculo opaco debe oscilar entre 20-24mm. Para la iluminación con luz incidente o iluminación oblicua se emplea un filtro en forma de luna en cuarto decreciente (en forma de C), obteniéndose una interesante imagen con relieve


Figura.- Modelos de filtros de fácil realización para lograr la técnica de campo oscuro (izquierda y centro) e iluminación oblicua (derecha, en cuarto decreciente). Para campo oscuro el diámetro de la máscara negra central dependerá del objetivo que se emplee.
Figura.- Modelos de filtros de fácil realización para lograr la técnica de campo oscuro (izquierda y centro) e iluminación oblicua (derecha, en cuarto decreciente). Para campo oscuro el diámetro de la máscara negra central dependerá del objetivo que se emplee.




El método más apropiado consiste en el empleo de un condensador característico que además mejora la resolución.

Figura .- Configuración esquemática del principio de iluminación de campo oscuro (luz transmitida). El filtro opaco es de forma circular y forma un cono de luz vacío que incide sobre el espécimen en forma oblicua y los rayos refractados, difractados y reflejados por el espécimen penetran en el sistema óptico del microscopio para formar la imagen.
Figura .- Configuración esquemática del principio de iluminación de campo oscuro (luz transmitida). El filtro opaco es de forma circular y forma un cono de luz vacío que incide sobre el espécimen en forma oblicua y los rayos refractados, difractados y reflejados por el espécimen penetran en el sistema óptico del microscopio para formar la imagen.


Con este dispositivo se forma un cono hueco de luz (cuyo centro es oscuro) que incide lateralmente sobre la muestra y sólo los rayos que son difractados o reflejados por las estructuras penetran en la lente objetivo y la célula aparece como un objeto luminoso sobre un fondo oscuro.
Figura .-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran diferencias de contraste entre los diversos tipos de iluminaciónEn campo oscuro, aún muchos detalles más pequeños son visibles. En iluminación oblicua se obtiene contraste con relieve. En campo claro el contraste es limitado.
Figura .-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran diferencias de contraste entre los diversos tipos de iluminaciónEn campo oscuro, aún muchos detalles más pequeños son visibles. En iluminación oblicua se obtiene contraste con relieve. En campo claro el contraste es limitado.








ILUMINACIÓN RHEINBERG
Inventada alrededor de 1895 por Julius Rheinberg. Se basa en la iluminación de campo oscuro. Es una forma de coloración óptica que emplea filtros de colores para iluminar tanto el espécimen como el fondo oscuro, obteniéndose imágenes con efectos muy atractivos y espectaculares, pero con la definición y datos de la iluminación de campo oscuro.
La iluminación Rheinberg combina la iluminación convencional de campo claro en un color con la iluminación de campo oscuro en otro color.
Figura.-Algunos ejemplos de modelos de filtros empleados para la iluminación Rheinberg que pueden ser fabricados con plástico de colores o pintados con marcadores permanentes para transparencias.
Figura.-Algunos ejemplos de modelos de filtros empleados para la iluminación Rheinberg que pueden ser fabricados con plástico de colores o pintados con marcadores permanentes para transparencias.





Figura.-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran el aspecto obtenido con la iluminación Rheinberg. En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro empleado. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination
Figura.-Micrografías de la superficie de una hoja que muestran el aspecto obtenido con la iluminación Rheinberg. En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro empleado. Modificado de Wim van Egmond (2002). 'Easy to make' contrast enhancement filters for the microscope dark-field, oblique and Rheinberg illumination

RESOLUCIÓN DE MICROSCOPIA EN CAMPO OSCURO


En la microscopia de campo oscuro la apertura numérica (AN) no debe ser superior a 1.0 ya que el condensador debe tener siempre una apertura numérica superior a este valor.
El límite de resolución del objetivo está dado por la siguiente fórmula:
LR = k x Long. onda
AN * k = Constante ( 0.61)
* Log. onda = 0.55 Se toma la longitud de onda de la franja verde –
amarilla
por ser el ojo humano más sensible a estos colores que a otros.
* AN = Apertura numérica no superior a 1.0

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y PROCEDIMIENTO DE LECTURA.


El material a estudio se emulsiona sobre un porta-objetos sobre el cual se coloca una gota de solución salina, se cubre con una laminilla y
se monta sobre la platina , se baja el condensador de campo oscuro y se corre con el carro de la platina la preparación de forma tal que al subir completamente el condensador la cara superior de su lente quede cubierta por su preparación solamente en su mitad posterior.
Sobre la parte descubierta del lente se coloca aceite de inmersión en cantidad adecuada, este por capilaridad se extiende entre la cara inferior del portaobjetos y la superior del lente del condensador. Se centra la preparación y se observa con objetivo de pequeño aumento colocando el foco luminoso en la mitad del campo mediante los tornillos de centraje del condensador.
Luego se observa el campo microscópico con el objetivo de gran aumento.
Treponema pallidum, visto en microscopio de campo oscuro
Treponema pallidum, visto en microscopio de campo oscuro

VENTAJAS

  • Permite ver partículas dispersas en un medio homogéneo.
  • Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas.
  • Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear.
  • Visualiza los bordes destacados de las muestras.
  • Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum, espiroquetas con diámetros superior a 0.2 um.




DESVENTAJAS

  • Difícil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su alto costo.
  • No deja visualizar estructuras celulares especificas, solo bordes de células o partículas.



APLICACIONES
  • Estudio de especímenes de tamaño pequeño no coloreados, tales como microorganismos acuáticos, células en cultivo (cuyos índices de refracción oscilan en un rango de 1.2 a 1.4 y no hay una diferencia notable con el índice de refracción de 1.3 de la solución acuosa en la cual se encuentran).
  • Observación de células móviles, como el Treponema pallidum, una espiroqueta causante de la sífilis, la cual con la microscopía óptica ordinaria es muy difícil de visualizar.
  • Estudio de procesos fisiológicos como mitosis y migración celular.







MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
external image small_314.jpg

Es un tipo de microscopio óptico que permite la observación de estructuras fluorescentes, ya sea naturales o artificiales.

El fenómeno de la fluorescencia se produce cuando un electrón de un átomo absorbe toda la energía de una determinada longitud de onda de la luz, saltando a otros orbitales. Es una situación inestable durante la cual se emite la mayor parte de la energía que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a su orbital.
Aprovechando este fenómeno, se han creado los flurocromos. Para utilizarlos necesitamos una bombilla que emita luz ultravioleta y luz visible. Para excitar el flurocromo necesitamos un filtro de excitación que seleccione la longitud de onda que excita nuestro flurocromo.

Figura.-Imagen que muestra el principio de la fluorescencia. Arriba se observa el rayo incidente (color azul claro) de una determinada longitud de onda, el cual es absorbido por las partículas fluorescentes (esferas naranja) que responden emitiendo otra luz, en este caso de color verde que exhibe una longitud de onda mayor que la de la luz incidente.
Figura.-Imagen que muestra el principio de la fluorescencia. Arriba se observa el rayo incidente (color azul claro) de una determinada longitud de onda, el cual es absorbido por las partículas fluorescentes (esferas naranja) que responden emitiendo otra luz, en este caso de color verde que exhibe una longitud de onda mayor que la de la luz incidente.



• Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes.
• Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de fluorescencia.

Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de absorción y de emisión específico que depende de la composición y estructura de la molécula fluorescente.


Fluorocromo

Longitud de onda de absorción (nm)
Longitud de onda de emisión (nm)
Cascade blue
374-403
422-430
Fluoresceína (FITC)
494
520
Rodamina (TRITC)
540
570
Naranja de acridina
460-502
526-650
Yoduro de propidio
536
617






Figura.-Espectro de excitación y de emisión de dos fluorocromos de uso común. La fluoresceína al ser excitada por una luz de longitud de onda de aproximadamente 495 nm (azul) emite una luz de color verde cuya longitud de onda esta alrededor de 519 nm. Modificado de Excitation and Emission Spectra of Fluorescent Dyes. Leica Microsystems
Figura.-Espectro de excitación y de emisión de dos fluorocromos de uso común. La fluoresceína al ser excitada por una luz de longitud de onda de aproximadamente 495 nm (azul) emite una luz de color verde cuya longitud de onda esta alrededor de 519 nm. Modificado de Excitation and Emission Spectra of Fluorescent Dyes. Leica Microsystems



DISEÑO DEL MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
• Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en el espectro específico de cada fluorocromo. Hay que tomar en cuenta que la fluorescencia es pasajera y la iluminación produce un efecto de fotoblanqueo en el fluorocromo; además, las células vivas pueden ser dañadas por la intensa radiación. La luz debe ser de una longitud de onda corta. Se emplean lámparas de mercurio a alta presión que funcionan de un modo diferente a las lámparas de filamentos incandescentes. También se utiliza luz ultravioleta y rayos laser.
• Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda, la del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no deseadas. Una vez filtrada, la luz incide sobre el espécimen por reflexión de un espejo dicroico (epi-iluminación) y es nuevamente filtrada para poder ser observada .
• Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numérica.
Figura.-Esquema básico de la iluminación en el microscopio de fluorescencia. La luz blanca emitida por la fuente de luz es filtrada dejando pasar por ejemplo, solo la luz azul. El espejo dicroico refleja la luz de cierta longitud de onda (en este caso azul) pero deja pasar otras. Filtra la luz azul que excita al fluorocromo (fluoresceína) pero por el contrario, deja pasar la luz verde emitida. Tomada de wikipedia.org
Figura.-Esquema básico de la iluminación en el microscopio de fluorescencia. La luz blanca emitida por la fuente de luz es filtrada dejando pasar por ejemplo, solo la luz azul. El espejo dicroico refleja la luz de cierta longitud de onda (en este caso azul) pero deja pasar otras. Filtra la luz azul que excita al fluorocromo (fluoresceína) pero por el contrario, deja pasar la luz verde emitida. Tomada de wikipedia.org



Los filtros empleados son útiles porque por ejemplo, cuando se emplea la fluoresceína, el espécimen se ilumina con una luz azul monocromática pura y filtrada. Para visualizarlo se emplea otro filtro el cual es completamente opaco a la luz azul pero deja pasar la luz verde (o amarilla y roja emitidas por otros fluorocromos).

Figura.-Micrografias de células en división, tomadas con un microscopio de fluorescencia. Se emplearon tres fluorocromos: DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomas, GFP (proteína verde fluorescente intracelular que emite luz verde) y rodamina (luz roja) para marcar microtúbulos. Cada fluorocromo amerita el uso de filtros específicos, dependiendo de la longitud de onda necesaria para su excitación, señalada arriba y a la izquierda en cada imagen y expresada en nm. Tomada de wikipedia.org
Figura.-Micrografias de células en división, tomadas con un microscopio de fluorescencia. Se emplearon tres fluorocromos: DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomas, GFP (proteína verde fluorescente intracelular que emite luz verde) y rodamina (luz roja) para marcar microtúbulos. Cada fluorocromo amerita el uso de filtros específicos, dependiendo de la longitud de onda necesaria para su excitación, señalada arriba y a la izquierda en cada imagen y expresada en nm. Tomada de wikipedia.org


VENTAJAS
• Es una herramienta de inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución microscópica.
• Utilizando anticuerpos dirigidos contra una proteína permite ubicarla en una célula (y en relación a otras proteínas o estructuras).
• Versatilidad de estudiar funciones y procesos en células vivas
APLICACIONES
  • En biología y medicina
  • Inmuno fluorescencia
Es la marcación de moléculas (principalmente proteínas) empleando anticuerpos específicos
Dibujo.JPG


  • Tinción de ADN
Generalmente se utilizan agentes como el ioduro de propidio.
Permiten ubicar células por sus núcleos, estudiar mitosis, ciclo celular, cariogramas, apoptosis.
También se pueden ubicar genes o secuencias particulares utilizando sondas fluorescentes específicas.
Dibujo1.JPG

  • Tinción de componentes celulares y organelas
    Citoesqueleto: utilizando anticuerpos específicos o empleando falloidina para identificar microfilamentos de actina.
    Núcleo y Organelas.




Microscopía de fluorescencia de una muestra con microorganismos endolíticos (endolítico = dentro de la piedra). En verde fluoresce el mineral y en rojo las bacterias
Microscopía de fluorescencia de una muestra con microorganismos endolíticos (endolítico = dentro de la piedra). En verde fluoresce el mineral y en rojo las bacterias








IMAGEN TRIDIMENSIONAL: MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE INTERFERENCIA, FUERZA ATÓMICA Y CONFOCAL

MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE INTERFERENCIA
external image huge665.jpg

Es una forma de microscopía óptica, también denominado microscopio Nomarski, o técnica DIC (Diffential-Interference Contrast), ideal para visualizar especímenes no coloreados y mucho más densos gracias a que la imagen proyectada es tridimensional.. Permite obtener información sobre la densidad óptica de la muestra y observar detalles que de ordinario son invisibles.
En 1930 Labedeff diseña primer microscopio de contraste interferencial. Y en 1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste Interferencial que lleva su nombre.



PRINCIPIO

Figura.-Disposición de los componentes básicos del microscopio de contraste por interferencia diferencial. Modificado de Wikipedia, Enciclopedia Libre
Figura.-Disposición de los componentes básicos del microscopio de contraste por interferencia diferencial. Modificado de Wikipedia, Enciclopedia Libre

Separar por completo la luz que se transmite directamente de la desviada por el objeto.
Emplea luz polarizada (blanca o monocromática), o sea que tiene la propiedad de concentrar los rayos dispersos en uno solo y se adicionan a los lentes objetivos cuatro componentes ópticos: Polarizador, prisma DIC, señalador DIC y un analizador.
El objeto espécimen que se encuentra en fase toma direcciones diferentes de acuerdo con los valores de grosor e índices de refracción que presente.
El prisma (birrefringente) situado sobre la parte posterior del plano focal del objetivo es usado para recombinar las dos ondas en un solo rayo.
El objeto atravesado por los dos rayos vuelve a otro prisma (Wollaston) que es el que en realidad crea la interferencia (destructiva o constructiva), así el plano polarizado es recapturado por un analizador, que transforma esto en ondas de vibración de la misma longitud y habilita la interferencia; como respuesta a estas.



dos últimas acciones tenemos que diferentes regiones del objeto estudiado aparecerán con más brillo o menos brillo sobre un fondo oscuro.

Los espacios laterales de las dos ondas se miden en términos de micrómetros y no se exceden en el tamaño de la resolución perceptible al ojo humano, logrando así que no se presente una doble imagen al observador.

Dando como resultado una imagen del espécimen en 3D o relieves que corresponden a las variaciones de la densidad óptica de la muestra con énfasis en líneas y bordes, como si la célula proyectara sombras hacia un lado.
Los objetos se ven oscuros o claros en un fondo gris.


DISEÑO DEL MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA DIFERENCIAL

Los componentes básicos del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski son iguales al microscopio óptico, difiriendo en los sistemas que transmiten el rayo de luz incidente estos son:

external image difractada2.jpg


  • Filtro polarizador plano: polariza el rayo de luz incidente que proviene de la lámpara en uno solo y con una misma longitud.
  • Prismas de Nomarski modificado por Wollaston: son dos, uno ubicado dentro del condensador birrefringente que genera dos rayos de luz paralelos formado un ángulo de 90?; el segundo se ubica en la parte posterior del objetivo, es ajustable y en él convergen los dos rayos de luz generados por el prisma inferior para que se recompongan.
  • Filtro polarizador o analizador: se ubica en la parte superior de los objetivos y del prisma superior y su función es recombinar los rayos de luz, para producir la imagen seudo-tridimensional observada a través del ocular.

Dibujo4.JPG
Imagen 3D de cèlulas mediante DIC

VENTAJA:

Nos da la posibilidad de observar células vivas y sin ninguna preparación , ya que al realizar otros procedimientos existe la posibilidad de que algunos de sus componentes puedan perderse o distorsionarse por métodos como la fijación, coloración, congelación, y otros.
  • Determinación de sólidos, masa seca y espesor de las estructuras celulares

DESVENTAJAS
  • Costo alto y mantenimiento cuidadoso de la muestra de células vivas
  • La microcinematografía requerida para mirar los procesos que realiza la célula in vivo requiere de equipos especiales y personal entrenado.

APLICACIONES
  • Estudio de células vivas en acción (mitosis o migración celular), no coloreada, las cuales pueden verse nítidas.
  • En el estudio de especímenes un tanto gruesos que no permiten el uso de contraste de fases.
  • En tratamientos de fertilización in-vitro.
  • Microcinematografía: Normalmente resulta útil hacer películas o vídeos por el sistema de aceleración de movimiento.
En esto casos, se toman fotografías sucesivas, separadas por breves períodos de tiempo, de modo que cuando la película o video registrados se proyectan a la velocidad normal los acontecimientos aparecen muy acelerados.










MICROSCOPIA DE FUERZA ATÓMICA
external image microscopio-de-fuerza-atomica-afm-para-aplicacion-metereologica-397062.jpg

Es una forma de microscopía óptica que resulta útil para producir imágenes tridimensionales.
El Microscopio de Fuerza Atómica (AFM, de sus siglas en inglés Atomic Force Microscope) es un instrumento mecano-óptico capaz de detectar fuerzas del orden de los nanonewton. Al analizar una muestra, es capaz de registrar continuamente su topografía mediante una sonda o punta cristalina de forma piramidal la cual está adherida a una barra flexible o cantiléver.

external image 3.jpg


PRINCIPIO
Existen fuerzas atómicas débiles de repulsión entre una fina aguja y la muestra, el cantiléver se dobla cuando la punta hace contacto con la muestra. La flexión de éste se mide a través de un detector al mismo tiempo que se efectúa un barrido sobre la superficie de la muestra.
El barrido puede consistir en mover la punta en distintas partes de la muestra o mover la muestra y dejar la punta fija. Así se reproducen los valles y las colinas de la muestra, registrando constantemente las interacciones con la superficie. Estas señales se registran en una serie de detectores que generan información digital a una computadora, la cual genera un mapa del relieve de la muestra.


Una de las fuerzas que actúan sobre el cantilever es la fuerza de Van del Waals que ocurre entre átomos. Esta fuerza puede ser de atracción o de repulsión, dependiendo de la distancia entre los átomos.
En virtud de que la señal a medir es muy débil, se hace necesario el uso de métodos sensibles con uso de corriente alterna. Para ello el sistema se hace vibrar cerca de la frecuencia de resonancia del cantilever, unos 100 a 400 ciclos por segundo. Los cambios en la frecuencia o amplitud de la vibración se miden a medida que la punta se acerca a la superficie.
La resolución del instrumento es de menos de 1 nm, y la pantalla de visualización permite distinguir detalles en la superficie de la muestra con una amplificación de varios millones de veces.
external image 250px-Microscopio_de_fuerza_atomica_esquema_v2.svg.png



**DIFERENTES FORMAS O MODOS DE FUNCIONAMIENTO**




VENTAJA:
  • El Microscopio de Fuerza Atómica provee la imagen de una superficie sin que intervenga los efectos eléctricos, al medir las fuerzas mecánicas en la punta detectora, por lo que también resulta útil para materiales no conductores, aislantes o semiconductores.
  • La punta al no tocar la muestra no la contamina.
  • Si la muestra es rígida las imágenes obtenidas en el modo con y sin contacto son similares
  • La muestra no requiera ni fijación, ni inclusión.
Bacteria E. Coli
Bacteria E. Coli


APLICACIONES
  • En esta técnica, la punta se hace vibrar cerca de la superficie pero sin llegar a tocarla, y sin embargo se pueden medir fuerzas ya que actúan las fuerzas de Van der Waals. Estas fuerzas son pequeñas, y esto hace adecuada la técnica para estudiar materiales blandos o elásticos.
  • El microscopio de fuerza atómica ha sido esencial en el desarrollo de la nanotecnología, para la caracterización y visualización de muestras a dimensiones nanométricas (1x10 − 9m = 1nm).







MICROSCOPIA CONFOCAL
external image huge962.jpg


A través de una computadora se reconstruye la imagen tomada por planos, a una imagen tridimensional.

Es un instrumento que permite realizar cortes ópticos finos a muestras de tejidos más o menos gruesos y realizar reconstrucciones en tres dimensiones a partir de cortes seriados. Fue inventado en el año 1955 por el científico estadounidense Marvin Minsky al estudiar neuronas. Su mecanismo, basado en el microscopio de fluorescencia hace posible la obtención de imágenes de la arquitectura tridimensional de células y tejidos.




PRINCIPIO
El microscopio confocal añade el principio de iluminar el espécimen punto por punto y elimina la luz proveniente de los planos no enfocados.
Para ello se necesita una fuente de luz muy potente, así como también un filtro con un agujero que se coloca en el trayecto del rayo de luz. En los microscopios modernos se emplea un rayo láser, cuya longitud de onda puede estar disponible en un amplio rango de frecuencias.
Figura.-Esquema que muestra de manera simplificada el principio del microscopio confocal y el trayecto de la luz. El rayo laser (luz azul) es filtrado por un agujero y un espejo dicroico; luego es enfocado mediante un lente objetivo sobre el espécimen y estimula la fluorescencia presente en el mismo (luz verde). La fluorescencia es recolectada por el objetivo y dirigida al espejo dicroico que la refleja y dirige hacia un detector. Un segundo filtro con agujero se coloca frente al detector y sólo deja pasar la luz proveniente del plano de enfoque (línea continua). La fluorescencia fuera de foco de las zonas que están por encima y por debajo del plano de enfoque (en líneas discontinuas) no pasa por el agujero y por lo tanto no formará parte de la imagen.
Figura.-Esquema que muestra de manera simplificada el principio del microscopio confocal y el trayecto de la luz. El rayo laser (luz azul) es filtrado por un agujero y un espejo dicroico; luego es enfocado mediante un lente objetivo sobre el espécimen y estimula la fluorescencia presente en el mismo (luz verde). La fluorescencia es recolectada por el objetivo y dirigida al espejo dicroico que la refleja y dirige hacia un detector. Un segundo filtro con agujero se coloca frente al detector y sólo deja pasar la luz proveniente del plano de enfoque (línea continua). La fluorescencia fuera de foco de las zonas que están por encima y por debajo del plano de enfoque (en líneas discontinuas) no pasa por el agujero y por lo tanto no formará parte de la imagen.


La luz del rayo láser es dirigida por espejos hacia el espécimen (tratado con marcadores fluorescentes) iluminándolo punto por punto. Para obtener la información completa, el rayo láser debe ser desplazado por todo el espécimen (en los planos x, y, z) y este proceso es lo que se conoce como escaneo o barrido. Para reconstruir las imágenes a 3D a partir de los datos obtenidos, se emplean programas de computación adecuados.



DISEÑO DEL MICROSCOPIO CONFOCAL

• La fuente de luz: Generalmente emplea una fuente de luz muy poderosa (láser). Se pueden utilizar sistemas de rayos láser multi-frecuencia (en el rango ultravioleta, luz visible e infra-roja) adaptados a los tipos de marcadores fluorescentes empleados para el contraste de los elementos celulares.
• Sistema óptico: Está basado en los principios fundamentales que se mantienen inalterados, sin embargo están complementados con los avances en óptica moderna y la tecnología electrónica.
• Filtros de interferencia: Incluyen espejos dicromáticos o dicroicos, barreras con agujero de diámetro variable y diversos filtros de excitación (para seleccionar la longitud de onda de excitación del fluorocromo).
• Detectores: Son fotodetectores muy sensibles a la fluorescencia emitida.
• Computadora: Configurada con los requisitos suficientes de memoria y procesador, tarjetas de video de alta resolución, complementadas con software de captura, análisis y procesamiento de imágenes, así como también de impresoras de muy alta calidad.




VENTAJAS
  • Uso de la fluorescencia.
  • Enfoca un solo plano del espécimen.
  • Elimina la información proveniente de otros planos no enfocados del espécimen.
  • Obtención de cortes ópticos seriados a partir de muestras con cierto grosor o cuyo corte fino se dificulta.
  • Gracias a programas de computación, se combinan los cortes ópticos seriados y a partir de ellos se reconstruye en tres dimensiones la estructura observada.
  • Este microscopio tiene mucho éxito en el mundo científico gracias a la alta calidad de las imágenes.

external image inclusio.gif


APLICACIONES
  • Proporciona un método altamente sofisticado y mejorado para obtener imágenes.

  • En investigaciones en el campo de la biología celular y biomedicina es muy útil para medir procesos dinámicos, realizar videos para capturar secuencias en muy corto tiempo en células vivas y otras
  • Procesos celulares: Para medir actividades enzimáticas, reacciones de oxidación, pH intracelular, fagocitosis, apoptosis, comunicaciones intercelulares.
  • Estudios de ADN y ARN.
  • Morfología de organoides citoplasmáticos.
  • Cirugía y otros métodos clínicos.






BIBLIOGRAFÍA:
  1. BROCK. Biología de los Microorganismos. PEARSON Prentice HALL. 10th edición. Págs.: 56-62
  2. Microscopía. http://www.angelfire.com/bc2/biologia/microscopia.htm 1/04/2011
  3. Microscopio óptico. http://www.monografias.com/trabajos82/microscopio-optico-compuesto/microscopio-optico-compuesto2.shtml 1/04/2011
  4. Microscopio óptico compuesto http://www.monografias.com/trabajos82/microscopio-optico-compuesto/microscopio-optico-compuesto.shtml 1/04/2011
  5. Christian Gatti - Pablo Orellana. Anátomo-Histología.Universidad Nacional del Sur. http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar/plantilla.asp?zona=modmicro 1/04/2011
  6. Microscopio de campo claro. http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/moptica.html 1/04/2011
  7. Microscopio de contraste de fase. Tecnología Médica Mención Morfofisiopatología y Citodiagnóstico. http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/microscopa-de-contraste-de-fase.html 1/04/2011
  8. Microscopio de interferencia diferencial de Nomarski. http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/mcontrsfases.htm 1/04/2011
  9. Microscopio de campo oscuro. http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/histologia/microscopio_de_campo_oscuro.pdf 1/04/2011
  10. Prof. Daniel J. Narváez Armas.Texto Electrónico complementario para el estudio del TEMA Nº 2 EL MICROSCOPIO del Programa Teórico de la asignatura Histología. La microscopía: herramienta para estudiar células y tejidos. http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo6_2.htm 1/04/2011
  11. Prof. Daniel J. Narváez Armas.Texto Electrónico complementario para el estudio del TEMA Nº 2 EL MICROSCOPIO del Programa Teórico de la asignatura Histología. La microscopía: herramienta para estudiar células y tejidos. Microscopio de campo oscuro. http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo6_1.htm 1/04/2011
  12. Prof. Daniel J. Narváez Armas.Texto Electrónico complementario para el estudio del TEMA Nº 2 EL MICROSCOPIO del Programa Teórico de la asignatura Histología. La microscopía: herramienta para estudiar células y tejidos. Microscopía de fluorescencia. http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo6_5.htm 1/04/2011
  13. Prof. Daniel J. Narváez Armas.Texto Electrónico complementario para el estudio del TEMA Nº 2 EL MICROSCOPIO del Programa Teórico de la asignatura Histología. La microscopía: herramienta para estudiar células y tejidos. Microscopía Confocal. http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo6_7.htm 1/04/2011
  14. Microscopio de fuerza atómica. http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_fuerza_at%C3%B3mica 1/04/2011
  15. Microscopio de fuerza atómica. http://www.fisica.uh.cu/bibvirtual/vida%20y%20tierra/microscopiofuerza%20atomica/index.htm 1/04/2011
  16. Microscopio de fuerza atómica. http://nanoquimica.awardspace.com/AFM.htm 1/04/2011
  17. Microscopía de fluorescencia. http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_fluorescencia 1/04/2011
  18. Microscopía de fluorescencia. http://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/qbiia/practicos/Microscopia%20de%20fluorescencia.pdf 1/04/2011